熒光定量PCR儀所用到的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性分析的目的。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)圖，達(dá)到監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。

　　一般而言，熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段、熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化；而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線(xiàn)性關(guān)系，因此根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，故選擇該階段進(jìn)行定量分析。為了較方便的進(jìn)行DNA拷貝數(shù)的定量，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中引入了三個(gè)非常重要的概念：基線(xiàn)、熒光閾值和Ct值。

　　基線(xiàn)：是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大，接近于一條直線(xiàn)，該直線(xiàn)即是基線(xiàn)。

　　熒光域值：一般將PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域值是PCR反應(yīng)3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。

　　Ct值：表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。各模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)難曲線(xiàn)，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

　　熒光定量PCR儀的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。運(yùn)用該項(xiàng)技術(shù)我們可以對(duì)DNA、RNA樣品進(jìn)行定量和定性分析。定量分析包括jue對(duì)定量分析和相對(duì)定量分析。前者可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對(duì)不同方式處理的兩個(gè)樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。除此之外還可以對(duì)PCR產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析，利用特異性探針進(jìn)行基因型分析及SNP檢測(cè)等。目前實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域，其中主要的應(yīng)用集中在以下幾個(gè)方面：

　　1.DNA或RNA的jue對(duì)定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi基因失活率的檢測(cè)等。

　　2.基因表達(dá)差異分析。如比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等)，特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證。

　　3.基因分型。例如SNP檢測(cè)，甲基化檢測(cè)等。